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激光共聚焦显微镜的操作步骤

发布时间:2021-07-16      点击次数:2198
激光扫描共聚焦荧光显微镜是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、目前先进的分子细胞生物学的分析仪器。主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化,定量分析,以及实时定量测定等。
 
传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管( PM T)或冷电耦器件( cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像。这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
 
与传统显微镜相比,激光激光激光共聚焦显微镜具有高分辨率,高灵敏度和高放大倍率。随着软件开发和应用技术的发展,激光激光激光共聚焦显微镜已成为形态学,分子细胞生物学,神经科学,药理学和遗传学领域的新一代强大的研究工具。
 
激光共聚焦显微镜的操作步骤:
 
1、根据荧光探针的激发和发射波长选择合适的激光,激光功率,光谱滤光片和发射滤光片。
2、确定扫描方法:点,线,面,3D扫描。
3、确定扫描密度(分辨率):256×256,512×512,1024×1024,2048×2048,分辨率越高,扫描速度越慢,图像信噪比越好,但越多可能会发生光漂白。
4、选择共焦显微镜物镜的倍数和电子放大倍率:确定此条件后,确定扫描范围,物镜的透光率与数值孔径(NA)的四次方成正比,并且物镜放大倍数的平方。因此,反比例,应尽可能选择具有高数值孔径的物镜。
5、根据样品的制备质量,选择合适的针孔尺寸,调节激光管电压,光电倍增管功率,降噪等,达到最佳状态。这些参数的选择或设置非常紧密,应该全面考虑。
6、确定光线切割范围,即扫描样品的厚度,起始位置和结束位置。
7、给出了由光切割的层数和拍摄时的累积平均次数。
8、获取图像并保存。
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