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规范操作让荧光光度计发挥实效

发布时间:2021-12-17      点击次数:218
  荧光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm,发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品(如凝胶条)的光谱扫描。
 
  荧光光度计的操作步骤:
 
  1.开机:接通电源,打开主机开关,点燃(打开)光源后,根据说明书要求启动计算机。
 
  2.检测前准备:参照仪器说明书,在20天内至少进行一次激发校准和发射校准,检测前仪器应预热。
 
  3.工作条件的选择:环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定,无磁场、电场干扰。根据样品的特性及荧光强度,选择合适的仪器工作条件(如狭缝、PM增益、响应时间等)。
 
  4.基本测定
 
  (1)荧光激发光谱测定
 
  设置仪器参数,扫描发射波长,找到maxλem,以此为发射波长,记录发射强度作为激发波长的函数,便得到激发光谱。
 
  (2)荧光发射光谱测定
 
  设置仪器参数,扫描激发波长,找到maxλex,以此为激发波长,记录发射强度与发射波长间的函数关系,便得到荧光发射光谱。
 
  (3)差谱测定
 
  设置仪器参数,选择合适的工作方式,测定背景溶液的发射光谱并储存起来,在一定的工作方式下,扫描样品溶液的发射波长,得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值,即差谱。
 
  (4)峰面积积分
 
  选择适当的工作方式,对样品溶液进行积分操作,即得到峰面积积分。
 
  (5)荧光强度
 
  选择合适的测量参数,设置λex、λem,采用定点读数或扫描方式,即可测得所选波长处的荧光强度。
 
  (6)定量测定
 
  配制一系列已知浓度的标准溶液,在一定的测定条件下,设置λex、λem,按照由稀至浓的次序,测定标准溶液的荧光强度,绘制荧光强度—浓度的工作曲线,不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度,由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。
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